Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Проверяют достоверность определения и вычисляют активность испытуемого препарата с использованием обычных статистических методов (например, 5.3. Статистический анализ результатов биологических испытаний и количественных определений).
2.7.5. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕПАРИНА
Антикоагулянтную активность гепарина определяют in vitro путем сравнения его способности в заданных условиях замедлять свертывание обогащенной кальцием и цитратом овечьей плазмы с аналогичной способностью препарата сравнения гепарина, калиброванного в Международных Единицах.
Международная Единица (МЕ) - активность, проявляемая установленным количеством Международного стандарта, состоящего из высушенной из замороженного состояния натриевой соли гепарина, полученной из свиных кишечных слизистых оболочек. Эквивалент Международного стандарта в МЕ устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.
Стандартный образец гепарина натриевой соли BRP калибруют в МЕ по сравнению с Международным стандартом с использованием изложенной ниже методики количественного определения.
Количественное определение выполняют одним из следующих методов установления начала свертывания с использованием пробирок и другого оборудования, соответствующего выбранному методу:
a) прямое визуальное наблюдение, предпочтительно, в отраженном свете на черном матовом фоне;
b) спектрофотометрическая регистрация изменения оптической плотности при длине волны около 600 нм;
c) визуальная фиксация изменения текучести путем производимого вручную опрокидывания пробирок;
d) механическая запись изменения текучести, определяемого по перемешиванию, с соблюдением мер предосторожности, направленных на минимизацию возмущений раствора в начальной стадии свертывания.
МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Приведенные в тексте объемы являются примерными и могут быть адаптированы к используемой аппаратуре при условии соблюдения соотношений между различными объемами.
Стандартный образец гепарина натриевой соли BRP разбавляют раствором натрия хлорида R концентрацией 9 г/л до получения точно известного количества МЕ в миллилитре, и готовят аналогичный раствор испытуемого препарата, для которого ожидается такая же активность. Используя раствор натрия хлорида R концентрацией 9 г/л, из каждого раствора готовят ряд разведений в геометрической прогрессии так, чтобы время свертывания, получаемое для низшей концентрации, не менее чем в 1,5 раза превышало время в контрольном опыте, а время свертывания, получаемое для высшей концентрации, давало значение, приводящее к построению удовлетворительной логарифмической кривой зависимости отклика от дозы, что определяется в ходе предварительного испытания.
Помещают двенадцать пробирок в баню с ледяной водой. Помечают их следующим образом: два ряда (Т1, Т2, Т3) для разведений испытуемого препарата и два ряда (Si, S2, S3) для разведений препарата сравнения. В каждую из пробирок помещают по 1,0 мл размороженного субстрата плазмы R1 и 1,0 мл соответствующего разведения испытуемого препарата или препарата сравнения.
После каждого из добавлений производят перемешивание, не допуская образования пузырьков. Для дальнейших манипуляций пробирки отбирают в порядке: S1, S2, S3, Т1, Т2, Т3. Каждую из пробирок приблизительно на 15 минут помещают в водяную баню, нагретую до температуры 370С, и добавляют к каждой из них 1 мл разведения цефалина R, к которому был добавлен соответствующий активатор, например, каолин, таким образом, чтобы время контрольного опыта было подходящим и не превышало 60 секунд. При использовании каолина непосредственно перед проведением испытания готовят смесь равных объемов цефалина R и суспензии легкого каолина R с его содержанием 4 г/л в растворе натрия хлорида R концентрацией 9 г/л. Ровно через 2 минуты добавляют 1 мл раствора кальция хлорида R концентрацией 3,7 г/л и регистрируют в качестве времени свертывания интервал, в секундах, между последним добавлением и началом свертывания, определяемым с помощью выбранного метода. В начале и в конце процедуры аналогичным образом определяют время контрольного опыта, используя вместо одного из разбавлений гепарина 1 мл раствора натрия хлорида R концентрацией 9 г/л; два полученных контрольных значения не должны существенно различаться. Времена свертывания переводят в логарифмы, используя средние значения для дублирующихся пробирок. Процедуру повторяют со свежими
разведениями, проводя инкубации в порядке: Ті, Т2, Т3, Si, S2, S3. Результаты вычисляют с использованием обычных статистических методов.
Проводят не менее трех независимых определений. Для каждого из таких определений готовят свежие растворы препарата сравнения и испытуемого препарата, и используют новую свежеразмороженную порцию субстрата плазмы.
Активность испытуемого препарата вычисляют путем комбинирования результатов этих определений с использованием обычных статистических методов. Если отклонение, вызванное различиями между результатами определений, является значительным при Р = 0,01, комбинированная оценка активности может быть получена путем вычисления простого среднего значения оценок активности.
